DNAสายพันธุ์ทุกชีวิต

ลำดับตอนที่ #4 : ตัวอย่างการสกัด DNA (ตอน1)

    การสกัด DNA นั้นก็มีได้หลายรูปแบบ แต่ที่จะนำมาอธิบายในวันนี้จะเป็นตัวอย่างการสกัด DNA จากผักบุ้งและผักชี เราลองมาดูกันว่าทำยังไงกัน

ตอนที่ 1 วิธีการสกัดDNA

1.      การเตรียม  Extraction  buffer  200 ml  ซึ่งเตรียมจากสารต่อไปนี้คือ

-  Tris-HCl  pH 8.8    100mM

- Disodium-EDTA   pH  8.0      50 mM

- NaCl          500 mM

- SDS        1.25%

- NaOH      8.3  mM

ปรับปริมาตรให้เป็น  200  ml  ด้วยน้ำกลั่นที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว

       2.  TE-buffer    100  ml    ซึ่งเตรียมได้จากสารต่อไปนี้

-  Tris-HCl  pH 8.0    50 mM

-  EDTA   pH  8.0      10 mM

ปรับปริมาตรด้วยน้ำปราศจากไอออนให้เป็น   100ml แล้วแบ่งใส่ขวดเล็กๆ   จากนั้นนำไป  Autoclave

       3.นำใบผักบุ้งและผักชีมาอย่างละ  20g  มาห่อด้วยกระดาษอะลูมิเนียมแล้วใส่ลงไปในกล่องโฟมที่มี  liquid  nitrogen

       4.  เตรียมโกร่งบดผักบุ้งและผักชีโดยนำ   liquid  nitrogen  มาใส่ในโกร่งบดประมาณ ¾  ของโกร่งบด

      5.  แกะห่อกระดาษอะลูมิเนียม   แล้วนำผักมาใส่ในโกร่งบดที่มี  liquid  nitrogen  จากนั้นบดใบผักจนละเอียดเป็นผง  (ต้องทำอย่างรวดเร็ว   ระวังอย่าให้เกิดการ thaw  )

      6.  ตักใบผักที่บดละเอียดใส่ลงไปในหลอด centrifuge  ขนาด  50 ml  แล้วเติม Extraction  buffer  23 ml  ที่แช่เตรียมไว้ใน water  bath  อุณหภูมิ  65°C  เขย่าให้เข้ากัน   แล้วนำไปอุ่นในwater  bath  65°C   เป็นเวลา 15นาที

     7.  เติม  5.0M  Potassium  acetate  7.1 ml  เขย่าให้เข้ากัน  นำไปใส่ในน้ำแข็ง  20นาที

     8.  กรองสารละลายที่ได้ผ่านผ้าขาวบางลงในหลอดcentrifuge  ขนาด 50ml อันใหม่แล้วเติม  isopropanol  ที่เย็นจัดลงไปปริมาณเท่ากับ  0.7 เท่า ของปริมาณสารละลายที่กรองได้  ค่อยๆเอียงหลอดกลับไปมา   จากนั้นนำไปแช่ในน้ำแข็ง  30 นาที

     9.  นำหลอด centrifuge  ไปปั่นที่ 4000 rpm   เป็นเวลา 10 นาที เทส่วน supernatant ทิ้งไปแล้วล้างตะกอนด้วย  ethanol  95%  2 ครั้ง (ปริมาตรขึ้นอยู่กับตะกอน)

    10.  ทำตะกอนให้แห้งโดยการคว่ำหลอด  centrifuge บนกระดาษทิชชู

    11.  ละลายตะกอนที่ได้ด้วย TE-buffer  pH  8.0  ปริมาตร 720 ไมโครลิตร  เมื่อตะกอนละลายหมด  เติม 7.4M  Ammonium  acetate  480 µl  ผสมโดยใช้ Vortex